FBL19 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407318-ACT

FBXL19 (FBL19) codifica uma proteína F-box que atua como componente de reconhecimento de substratos dos complexos de ligase E3 de ubiquitina do tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), ligando proteínas específicas à degradação dependente de ubiquitina. Por meio de uma proteostase regulada, o FBXL19 contribui para o controle de transições de estado celular e de programas transcricionais, com funções descritas em processos associados à cromatina e na regulação gênica dependente de sinalização. Como parte das vias do sistema ubiquitina–proteassoma, alterações na atividade de FBXL19 podem perturbar a homeostase proteica e redes a jusante que governam proliferação, diferenciação e respostas ao estresse. A desregulação de ligases de ubiquitina, incluindo proteínas F-box, é frequentemente associada à biologia do câncer e a fenótipos do desenvolvimento, tornando o FBXL19 um nó relevante para estudos mecanísticos.

FBL19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBXL19 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FBL19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBXL19 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBXL19, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FBL19. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBXL19 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FBL19 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FBL19 em células tumorais com expressão de FBXL19 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.