Fatso Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403708-ACT

O FTO (Fatso) humano codifica uma desmetilase de RNA dependente de Fe(II)/2-oxoglutarato que catalisa a remoção de N6-metiladenosina (m6A) e de marcas metiladas relacionadas, modulando assim a estabilidade, o splicing e a tradução de mRNAs. Por meio do controle dependente de m6A do destino dos transcritos, o FTO influencia programas de detecção de nutrientes, adipogênese e homeostase energética, integrando-se a vias que regulam o metabolismo celular e respostas ao estresse. Alterações na expressão ou na atividade de FTO têm sido associadas a fenótipos metabólicos e características ligadas à obesidade, e o gene também é estudado em contextos em que a regulação epitranscritômica do RNA molda transições de estado celular. Como resultado, o FTO é amplamente utilizado como um ponto de investigação para entender como a metilação de RNA impacta redes de regulação gênica e o remodelamento metabólico em células humanas.

Fatso O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FTO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fatso O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FTO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FTO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fatso. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FTO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fatso no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fatso em células tumorais com expressão de FTO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.