FAT10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402682-ACT

O gene humano UBD codifica a FAT10, um modificador do tipo ubiquitina induzível por interferão e TNF, que é conjugado a proteínas substrato através de uma cascata enzimática semelhante a E1/E2/E3 para promover uma degradação rápida dependente do proteassoma. A FAT10 participa na regulação do imunoproteassoma, no processamento de antigénios e na sinalização inflamatória, interagindo com vias associadas à atividade de NF-κB, às respostas ao stress celular e ao controlo de qualidade das proteínas. A expressão desregulada de UBD/FAT10 tem sido associada a inflamação crónica e a alterações da proteostase em múltiplos contextos de doença, incluindo a biologia do cancro, onde é frequentemente estudada pelos seus efeitos no controlo do ciclo celular, na apoptose e na estabilidade genómica. A FAT10 também constitui um ponto de entrada mecanístico para estudar dinâmicas de modificação por proteínas do tipo ubiquitina distintas da ubiquitinação canónica.

FAT10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAT10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAT10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAT10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAT10 em células tumorais com expressão de UBD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.