EVL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404876-ACT

A EVL humana (Ena/VASP-like) codifica uma proteína reguladora de actina da família Ena/VASP que promove o alongamento de filamentos e controla a dinâmica de lamelipódios e filopódios durante o espalhamento, a adesão e a migração celular. A EVL atua a jusante da sinalização de integrinas e de receptores tirosina-quinase, coordenando a remodelação do citoesqueleto com a renovação das adesões focais e a protrusão de membrana. Ao moldar a arquitetura de actina, a EVL contribui para processos como o tráfego de células imunes, a regulação da barreira endotelial e o crescimento de neuritos. Alterações na expressão de EVL ou no contexto das vias em que atua têm sido estudadas em doenças que envolvem motilidade celular desregulada e remodelação tecidual, incluindo fenótipos de câncer invasivo e patobiologia inflamatória.

EVL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EVL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EVL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EVL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EVL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EVL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EVL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EVL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EVL em células tumorais com expressão de EVL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.