Plasmide CRISPR/Cas9 KO Estrogen Receptor beta (m): sc-420232

Présentation

Esr2 code le récepteur des estrogènes bêta (ERβ), un récepteur nucléaire activé par un ligand qui régule des programmes transcriptionnels en réponse aux estrogènes en se liant aux éléments de réponse aux estrogènes et en s'associant à des corégulateurs. Dans les tissus de souris, ERβ contribue à la différenciation cellulaire, au contrôle de la prolifération et à la modulation de l'inflammation, en s'articulant avec les voies de signalisation MAPK/ERK et PI3K/AKT ainsi qu'avec le dialogue (crosstalk) avec d'autres récepteurs des hormones stéroïdiennes. L'activité d'ERβ influence le développement et l'homéostasie des systèmes reproducteur, nerveux, immunitaire et squelettique, et sa dérégulation a été associée à des phénotypes dépendants du système endocrinien ainsi qu'à des altérations des voies de croissance et de réponse au stress. En tant que facteur de transcription, ERβ constitue un point d'entrée pertinent pour disséquer les réseaux géniques pilotés par les hormones et la signalisation des récepteurs dépendante du contexte.

Le Estrogen Receptor beta CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Esr2 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Esr2, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Estrogen Receptor beta plasmide HDR (m) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Esr2 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Estrogen Receptor beta CRISPR/Cas9 KO (m):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Esr2.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Esr2 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons Esr2 essentiels à la fonction Estrogen Receptor beta
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.