ERCC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400630-ACT

ERCC1 kodiert eine strukturspezifische Endonuklease, die mit XPF (ERCC4) einen funktionellen Heterodimer bildet, um während der Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) die Schnittschritte auszuführen und in Abstimmung mit dem Fanconi-Anämie‑Signalweg DNA‑Interstrang‑Quervernetzungen zu lösen. Durch diese Aktivitäten trägt ERCC1 zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität bei, unterstützt die Erholung von Replikationsgabeln und begrenzt die Anhäufung von DNA‑Schäden, die durch UV‑Licht und genotoxische Agenzien verursacht werden. Eine veränderte ERCC1‑Funktion oder -Expression ist mit einer beeinträchtigten DNA‑Reparaturkapazität, einer erhöhten Mutationslast und einer zellulären Überempfindlichkeit gegenüber DNA‑schädigendem Stress verbunden. ERCC1‑abhängige Reparaturprozesse werden daher häufig in Kontexten wie Karzinogenese, altersassoziierter Genomwartung sowie Mechanismen der Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber DNA‑Schäden in experimentellen Systemen untersucht.

ERCC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ERCC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERCC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ERCC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ERCC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERCC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ERCC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERCC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERCC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ERCC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.