EphA4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400729-ACT

EPHA4 codifica EphA4, una tirosin-chinasi recettoriale della famiglia Eph/ephrin che media una segnalazione dipendente dal contatto per regolare la guida assonale, la formazione delle sinapsi e la migrazione cellulare. L’attivazione di EphA4 coinvolge la segnalazione delle GTPasi della famiglia Rho, le vie MAPK e il rimodellamento del citoscheletro per controllare l’adesione e la formazione di confini durante lo sviluppo e nei tessuti adulti. Nella biologia umana, alterazioni della segnalazione di EPHA4 sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e neurodegenerativi, e l’attività disregolata dei recettori Eph è spesso studiata nell’invasione delle cellule tumorali e nella segnalazione angiogenica. Queste funzioni rendono EPHA4 un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla connettività neuronale, la patterning tissutale e le reti di segnalazione guidate dai recettori.

EphA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphA4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphA4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphA4 nelle cellule tumorali con espressione di EPHA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.