EHD3 CRISPR Activationプラスミド (h2): sc-404685-ACT-2

ヒトEHD3（EHドメイン含有タンパク質3）は、エンドサイトーシス後のリサイクリングと膜チューブ形成を制御するEHDファミリーのATPアーゼであり、初期エンドソームからリサイクリングエンドソームを経て形質膜へ戻る輸送を協調的に調節する。Rabエフェクターや膜結合性パートナーとの相互作用を介して、EHD3は受容体の取り込みと再利用、小胞の切断、ならびに細胞極性や遊走を形作るシグナル伝達プラットフォームの空間的配置に影響を及ぼす。EHD3の発現変動は、がん生物学で観察されるエンドソーム輸送プログラムの破綻や、膜リサイクリングがシナプス機能および細胞恒常性に影響する神経学的文脈に関連づけられている。ヒト細胞モデルにおけるEHD3の遺伝子編集は、イメージング、プロテオミクス、および小胞動態の機能アッセイを用いて、エンドソームから膜への輸送機構、受容体運命の決定、そして下流シグナル伝達への影響を機構的に解析することを可能にする。

EHD3 CRISPR活性化プラスミド（h2）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性EHD3の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

EHD3 CRISPR 活性化プラスミド (h2) は、ヒト細胞株における EHD3 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はEHD3転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性EHD3の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のEHD3遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるEHD3依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびEHD3発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるEHD3経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。