EFP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402678-ACT

TRIM25 umano codifica l’E3 ubiquitin ligasi EFP, una proteina con dominio RING finger che regola la segnalazione dell’immunità innata e il metabolismo dell’RNA attraverso l’ubiquitinazione di substrati chiave. EFP promuove le risposte antivirali modulando le vie dei recettori di tipo RIG-I e la segnalazione a valle dell’interferone di tipo I, e può influenzare l’attivazione di NF-κB e programmi trascrizionali sensibili allo stress. Oltre all’immunità, TRIM25 partecipa al controllo post-trascrizionale tramite interazioni con proteine leganti l’RNA, con effetti sulla stabilità degli mRNA e sulla traduzione. Un’attività deregolata di TRIM25/EFP è stata associata ad alterazioni della segnalazione infiammatoria e a fenotipi associati ai tumori, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in biologia delle infezioni, regolazione immunitaria e segnalazione cellulare nel cancro.

EFP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM25 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EFP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM25 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM25, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EFP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM25 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EFP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EFP nelle cellule tumorali con espressione di TRIM25 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.