EF-1 α2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401444-ACT

EEF1A2 codifica o fator de elongação da tradução humana EF-1α2, uma GTPase que entrega aminoacil-tRNAs ao sítio A do ribossomo e ajuda a manter uma síntese proteica eficiente e de alta fidelidade. Para além da tradução propriamente dita, o EF-1α2 tem sido associado à organização do citoesqueleto e a programas de crescimento celular, ao acoplar a capacidade translacional a redes de sinalização que regulam proliferação, adaptação ao estresse e diferenciação. Alterações na expressão ou na atividade de EEF1A2 têm sido associadas à desregulação da proteostase e à remodelação do estado celular observadas em múltiplos contextos de doença, incluindo fenótipos do neurodesenvolvimento e transformação oncogênica. Assim, EEF1A2 é um ponto útil para estudar o controle translacional, a homeostase do proteoma e como mudanças no equilíbrio de fatores de elongação remodelam fenótipos celulares.

EF-1 α2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EEF1A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EF-1 α2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EEF1A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EEF1A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EF-1 α2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EEF1A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EF-1 α2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EF-1 α2 em células tumorais com expressão de EEF1A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.