E2F-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400851-ACT

E2F4 codifica o fator de transcrição humano E2F-4, um regulador-chave da expressão de genes do ciclo celular que, em geral, atua com proteínas DP e repressores da família RB para controlar a transição de G0/G1 para a fase S. E2F-4 participa de complexos associados ao DREAM e às pocket proteins, que coordenam a repressão e a ativação temporizada de genes envolvidos na replicação do DNA, na progressão mitótica e no controle de checkpoints. Por meio do seu papel em programas de sinalização proliferativa e de diferenciação, alterações na atividade de E2F4 podem contribuir para o descontrole do ciclo celular, instabilidade genômica e estados transcricionais oncogênicos. Assim, redes transcricionais dependentes de E2F-4 são amplamente estudadas em biologia do câncer, senescência e contextos do desenvolvimento, nos quais a saída e a reentrada no ciclo celular são rigidamente reguladas.

E2F-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de E2F4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

E2F-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus E2F4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição E2F4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de E2F-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus E2F4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de E2F-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via E2F-4 em células tumorais com expressão de E2F4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.