DRP1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428678-ACT

Il gene murino Dnm1l codifica la proteina 1 correlata alla dinammina (DRP1), una grande GTPasi che orchestral la fissione mitocondriale e perossisomiale assemblandosi sulle membrane degli organelli e restringendole in modo dipendente dal GTP. DRP1 integra segnali derivanti da fosforilazione, SUMOilazione e ubiquitinazione per collegare la dinamica della fissione allo stato energetico cellulare, all’omeostasi del Ca2+ e alla gestione delle specie reattive dell’ossigeno. Grazie al suo ruolo centrale nel rimodellamento della rete mitocondriale, DRP1 influenza la mitofagia, la sensibilità all’apoptosi e la progressione del ciclo cellulare, rendendo la regolazione di Dnm1l altamente rilevante per studi su neurodegenerazione, stress cardiometabolico, infiammazione e adattamento delle cellule tumorali. Alterazioni dell’attività di DRP1 sono comunemente associate a bioenergetica modificata e a vie di controllo qualità degli organelli, inclusa la mitofagia associata a PINK1/Parkin e la segnalazione mediata da chinasi attivate dallo stress.

DRP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dnm1l senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DRP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dnm1l nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dnm1l, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DRP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dnm1l nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DRP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DRP1 nelle cellule tumorali con espressione di Dnm1l silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.