DOT1L1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403286-ACT

DOT1L umano (DOT1L1) codifica una metiltransferasi istonica delle lisine che catalizza la mono-, di- e trimetilazione di H3K79, un marcatore epigenetico associato alla trascrizione attiva all’interno dei corpi genici. La regolazione della cromatina dipendente da DOT1L sostiene l’elongazione della RNA polimerasi II, la comunicazione tra enhancer e promotore e il coordinamento della segnalazione del danno al DNA con la progressione del ciclo cellulare. Attraverso il controllo di programmi trascrizionali specifici di linea, DOT1L influenza la differenziazione ematopoietica e reti geniche di sviluppo più ampie. Un’attività di DOT1L deregolata e stati alterati di metilazione di H3K79 sono associati a una riconfigurazione aberrante della trascrizione osservata nella leucemia e in altri tumori, nonché a effetti dipendenti dal contesto sulla stabilità del genoma.

DOT1L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DOT1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOT1L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DOT1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DOT1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOT1L1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DOT1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOT1L1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOT1L1 nelle cellule tumorali con espressione di DOT1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.