Dkk-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403725-ACT

O DKK2 humano codifica a proteína Dickkopf-related 2 (Dkk-2), um modulador secretado da sinalização Wnt que regula interações receptor–ligante na superfície celular, incluindo efeitos sobre a atividade das vias dependentes de LRP5/6 e de Frizzled. Ao ajustar a sinalização canônica de β-catenina, bem como respostas Wnt não canônicas dependentes do contexto, a Dkk-2 influencia decisões de destino celular, proliferação, diferenciação e morfogênese tecidual. Alterações na expressão de DKK2 foram relatadas em diversos contextos relevantes para doenças, incluindo oncologia e distúrbios envolvendo regulação aberrante da via Wnt, tornando-o um alvo útil para dissecar a dinâmica da via e programas transcricionais.

Dkk-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DKK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dkk-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DKK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DKK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dkk-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DKK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dkk-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dkk-2 em células tumorais com expressão de DKK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.