Dab2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419936-ACT

Disabled homolog 2 (Dab2) è una proteina adattatrice dell’endocitosi che collega i recettori di membrana all’internalizzazione e allo smistamento mediati dalla clatrina, influenzando il traffico dei recettori, l’attenuazione del segnale e le risposte trascrizionali a valle. Nelle cellule murine, Dab2 interagisce con carichi contenenti motivi di legame alla fosfotirosina e partecipa a vie collegate alla segnalazione di TGF-β, alla modulazione di Wnt/β-catenina e alle dinamiche del citoscheletro che influenzano adesione e migrazione. Modellando la disponibilità e la compartimentalizzazione dei recettori, Dab2 contribuisce alle decisioni sul destino cellulare durante lo sviluppo e l’omeostasi tissutale. Un’espressione o una localizzazione disregolate di DAB2 sono state associate ad alterazioni dei programmi di differenziamento e a stati di segnalazione oncogenici, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici della biologia tumorale e delle transizioni epitelio–mesenchimali.

Dab2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dab2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dab2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dab2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dab2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dab2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dab2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dab2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dab2 nelle cellule tumorali con espressione di Dab2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.