D4DR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402947-ACT

Il gene umano **DRD4** codifica il recettore della dopamina D4 (**D4DR**), un GPCR accoppiato a **Gi/o** che modula l’attività dell’adenilato ciclasi, la segnalazione **cAMP/PKA** e i programmi di fosforilazione a valle che plasmano l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica. D4DR attiva anche vie legate a **MAPK** e **β-arrestina**, influenzando la desensibilizzazione del recettore, il trafficking e risposte trascrizionali a più lungo termine al tono dopaminergico. L’espressione di DRD4 e le sue variazioni regolatorie sono state studiate nel contesto della funzione dei circuiti frontostriatali e dei fenotipi neuropsichiatrici, rendendolo un nodo molecolare utile per analizzare le dinamiche della segnalazione dopaminergica. Nei modelli cellulari, la perturbazione di DRD4 può essere impiegata per esplorare l’accoppiamento delle vie di segnalazione, la farmacologia del recettore e le risposte trascrizionali alla dopamina in sistemi neurali rilevanti e in sistemi di espressione eterologa.

D4DR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DRD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

D4DR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DRD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DRD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di D4DR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DRD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da D4DR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via D4DR nelle cellule tumorali con espressione di DRD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.