Plásmido CRISPR de Activación (h) Cytokeratin 19: sc-400281-ACT

KRT19 codifica la citoqueratina 19, una proteína de filamentos intermedios de tipo I que contribuye a la integridad estructural y la resiliencia mecánica de los epitelios simples. La citoqueratina 19 participa en la organización del citoesqueleto, la dinámica de adhesión célula–célula y las respuestas epiteliales al estrés, y su expresión se utiliza habitualmente para definir estados de linaje epitelial y programas de diferenciación. Los patrones alterados de expresión de KRT19 se asocian con la remodelación epitelial, las respuestas a lesiones inflamatorias y la transformación oncogénica, en las que los cambios en la composición de los filamentos acompañan variaciones en la proliferación y la motilidad. Como marcador de linaje y de estado, la citoqueratina 19 se estudia con frecuencia en vías relacionadas con la plasticidad epitelial, la señalización asociada al citoesqueleto y la heterogeneidad tumoral.

Cytokeratin 19 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KRT19 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cytokeratin 19 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KRT19 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KRT19, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cytokeratin 19. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KRT19 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cytokeratin 19 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cytokeratin 19 en células tumorales con expresión de KRT19 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.