CUL-5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401344-ACT

O CUL5 humano codifica a cullina-5 (CUL-5), um componente de suporte (scaffold) dos complexos de ligase de ubiquitina E3 do tipo cullina-RING, que promovem a poliubiquitinação e a degradação proteassomal de substratos específicos. Por meio da montagem com elongina B/C e proteínas adaptadoras com SOCS-box, a CUL-5 regula a homeostase proteica, a amplitude da transdução de sinal e programas do ciclo celular e de resposta ao stress, ao controlar a estabilidade de intermediários de sinalização. A sinalização de ubiquitina dependente de CUL-5 interseta-se com vias que governam respostas a citocinas e fatores de crescimento, influenciando assim a proliferação, a diferenciação e a regulação da imunidade inata. A expressão desregulada de CUL5 ou a atividade alterada do complexo CRL5 tem sido implicada na biologia do câncer e em outras doenças associadas a uma proteostase aberrante mediada por ubiquitina.

CUL-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CUL5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CUL-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CUL5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CUL5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CUL-5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CUL5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CUL-5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CUL-5 em células tumorais com expressão de CUL5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.