CstF-77 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404038-ACT

CSTF3 codifica a subunidade de 77 kDa do fator estimulador de clivagem (CstF-77), um componente central da maquinaria de processamento da extremidade 3′ do pré-mRNA, que acopla a clivagem e a poliadenilação à terminação da transcrição. Ao coordenar o reconhecimento dos sinais de poli(A) com outros fatores de CPA, o CstF-77 ajuda a moldar a estabilidade dos transcritos, a exportação nuclear e a produção de proteínas por meio da poliadenilação alternativa e do controlo do comprimento da 3′ UTR. Perturbações na dosagem ou na atividade de fatores de CPA podem deslocar a seleção global de sítios de poli(A) e reprogramar redes de expressão génica que governam a proliferação, a diferenciação e as respostas ao stress. Assim, o CSTF3 é frequentemente estudado no contexto da desregulação do processamento de RNA e das suas associações com estados transcricionais oncogénicos e anomalias mais amplas de expressão génica.

CstF-77 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CSTF3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CstF-77 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CSTF3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CSTF3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CstF-77. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CSTF3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CstF-77 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CstF-77 em células tumorais com expressão de CSTF3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.