CstF-64 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402202-ACT

CSTF2 codifica a CstF-64, uma subunidade de ligação a RNA do complexo fator estimulador de clivagem (CstF) que reconhece elementos de sequência a jusante ricos em GU/U para promover a clivagem da extremidade 3′ do pré‑mRNA e a poliadenilação. Ao controlar a escolha de sítios alternativos de poliadenilação, a CstF-64 modula o comprimento da 3′ UTR, a estabilidade do mRNA, a eficiência de tradução e a localização dos transcritos, associando-se à regulação global da expressão gênica durante a proliferação e a diferenciação. A poliadenilação dependente de CSTF2 interage com a terminação da transcrição e com vias de processamento de RNA, influenciando a diversidade de isoformas e redes regulatórias pós-transcricionais. A desregulação da poliadenilação alternativa e do processamento da extremidade 3′ está associada a programas gênicos oncogênicos e do desenvolvimento alterados, tornando CSTF2 um alvo relevante para estudos mecanísticos da maturação de RNA e da remodelação do transcriptoma associada a doenças.

CstF-64 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CSTF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CstF-64 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CSTF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CSTF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CstF-64. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CSTF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CstF-64 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CstF-64 em células tumorais com expressão de CSTF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.