Plásmido CRISPR de Activación (h) cSHMT: sc-403678-ACT

El SHMT1 humano codifica la serina hidroximetiltransferasa citosólica (cSHMT), una enzima dependiente de fosfato de piridoxal que cataliza de forma reversible la conversión de serina en glicina, a la vez que genera 5,10‑metilentetrahidrofolato para el metabolismo de un carbono. La cSHMT conecta la biosíntesis de nucleótidos dependiente de folato con la capacidad de metilación al aportar unidades de un carbono para la síntesis de timidilato y purinas y coordinar un flujo metabólico sensible al estado redox. A través de su papel en las vías de folato/monocarbono, SHMT1 influye en la fidelidad de la replicación y reparación del ADN, la regulación epigenética y las respuestas celulares a la disponibilidad de nutrientes. La desregulación de este eje se examina con frecuencia en modelos de estrés proliferativo y reprogramación metabólica, con implicaciones para fenotipos de enfermedad asociados a la estabilidad genómica.

cSHMT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SHMT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cSHMT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SHMT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SHMT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cSHMT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SHMT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cSHMT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cSHMT en células tumorales con expresión de SHMT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.