creatine kinase-B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401868-ACT

O CKB humano codifica a creatina quinase B, uma fosfotransferase citosólica que catalisa a transferência reversível de fosfato entre ATP e creatina para gerar fosfocreatina, sustentando um tamponamento rápido de ATP em células com demanda energética flutuante. Ao acoplar os produtos da glicólise e da fosforilação oxidativa à regeneração localizada de ATP, a creatina quinase B contribui para a bioenergética celular, o transporte de íons e a dinâmica do citoesqueleto, particularmente em tecidos neurais e outros tecidos excitáveis. Alterações na expressão de CKB e na atividade da creatina quinase têm sido associadas a respostas ao estresse metabólico e foram relatadas em estudos de disfunção neurológica e da bioenergética de células tumorais, refletindo sua utilidade como marcador e como nó mecanístico em pesquisas sobre homeostase energética.

creatine kinase-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CKB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

creatine kinase-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CKB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CKB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de creatine kinase-B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CKB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de creatine kinase-B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via creatine kinase-B em células tumorais com expressão de CKB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.