CRB3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403145-ACT

CRB3 (crumbs homolog 3) kodiert ein apikales Polaritätsprotein, das an Tight-Junction-assoziierten Komplexen lokalisiert und zur Organisation der Architektur epithelialer Zellen beiträgt. Durch die Unterstützung der apikal-basolateralen Polarität, der Integrität von Zell-Zell-Kontakten und des Vesikeltransports trägt CRB3 zu Prozessen wie Lumenbildung, Ziliogenese und regulierter Proliferation über polaritätsassoziierte Signalnetzwerke bei. Eine veränderte CRB3-Expression oder -Lokalisation wurde mit dem Verlust epithelialer Organisation und einer gestörten Gewebehomöostase in Verbindung gebracht – Merkmale, die häufig in Studien zur Tumorprogression und Metastasierung untersucht werden. Als konservierter Polaritätsdeterminant wird CRB3 in humanen Zellmodellen häufig als molekulares Werkzeug genutzt, um epitheliale Differenzierung und Barrierefunktion zu untersuchen.

CRB3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRB3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRB3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRB3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRB3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRB3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRB3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRB3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRB3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRB3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.