CPTI Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419786-ACT

O gene Cpt1a de camundongo codifica a carnitina palmitoiltransferase 1A (CPTI), a enzima limitante de velocidade que controla a importação mitocondrial de ácidos graxos de cadeia longa para a β-oxidação por meio da lançadeira de carnitina. Ao regular a produção de acetil-CoA e o fluxo energético, a CPTI integra a disponibilidade de nutrientes com a respiração mitocondrial e influencia a homeostase lipídica, o equilíbrio redox e a sinalização metabólica. A atividade de Cpt1a molda as respostas celulares ao jejum e a condições de alta ingestão de gordura, e contribui para a remodelação metabólica em tecidos com alta demanda oxidativa. A desregulação da oxidação de ácidos graxos ligada à CPTI tem sido associada a fenótipos metabólicos relevantes para a sensibilidade à insulina, o manejo hepático de lipídios e estados de ativação inflamatória em modelos murinos.

CPTI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cpt1a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CPTI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cpt1a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cpt1a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CPTI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cpt1a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CPTI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CPTI em células tumorais com expressão de Cpt1a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.