CPSF4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403190-ACT

O CPSF4 humano (fator de especificidade de clivagem e poliadenilação, subunidade 4) é um componente essencial do complexo CPSF, que reconhece o sinal de poliadenilação AAUAAA e coordena a clivagem da extremidade 3′ e a adição da cauda poli(A) em pré-mRNAs. Ao acoplar a terminação da transcrição à maturação do mRNA, o CPSF4 ajuda a moldar a estabilidade dos transcritos, a exportação nuclear e a eficiência de tradução, conectando o processamento de RNA ao controle global da expressão gênica. Alterações na poliadenilação dependente de CPSF4 podem deslocar o uso de sítios alternativos de poli(A) e modificar o equilíbrio de isoformas, com efeitos a jusante sobre programas do ciclo celular, respostas ao estresse e diferenciação. Paisagens desreguladas de processamento da extremidade 3′ e de poliadenilação são características recorrentes do câncer e de outros distúrbios proliferativos ou associados ao metabolismo de RNA, tornando o CPSF4 um nó útil para estudos mecanísticos de fenótipos impulsionados pelo processamento de RNA.

CPSF4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CPSF4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CPSF4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CPSF4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CPSF4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CPSF4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CPSF4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CPSF4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CPSF4 em células tumorais com expressão de CPSF4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.