COL5A1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401579-ACT

COL5A1 codifica a cadeia pro‑α1(V) do colagénio tipo V, um colagénio fibrilar que se co‑monta com o colagénio tipo I para regular a fibrilogénese do colagénio e a arquitetura da matriz extracelular (MEC). Ao controlar a nucleação e o diâmetro das fibras de colagénio, o COL5A1 influencia a resistência à tração do tecido conjuntivo, a adesão célula–matriz e programas de mecanotransdução que moldam o desenvolvimento e a remodelação dos tecidos. A organização da MEC associada ao COL5A1 cruza‑se com vias que regulam a reparação de feridas e a remodelação do estroma, incluindo a sinalização por integrinas/FAK e a deposição de matriz ligada ao TGF‑β. Alterações genéticas em COL5A1 estão implicadas em doenças hereditárias do tecido conjuntivo, e a expressão alterada é frequentemente estudada no contexto da fibrose e da biologia do microambiente tumoral.

COL5A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de COL5A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

COL5A1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus COL5A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição COL5A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de COL5A1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus COL5A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de COL5A1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via COL5A1 em células tumorais com expressão de COL5A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.