CNT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404790-ACT

SLC28A1 codifica o transportador concentrativo de nucleósidos 1 (CNT1), um transportador de membrana plasmática de alta afinidade, dependente de sódio, que medeia a captação celular de nucleósidos pirimidínicos como a uridina e a citidina. Ao controlar a via de salvamento de nucleósidos, o CNT1 contribui para a homeostase do pool de nucleótidos necessária para a síntese de DNA/RNA, a progressão do ciclo celular e as respostas ao stress metabólico. A atividade do CNT1 cruza-se com o metabolismo de purinas/pirimidinas e pode influenciar a sensibilidade a perturbações experimentais baseadas em análogos de nucleósidos, ao alterar a disponibilidade intracelular de substratos. A desregulação da expressão de SLC28A1 foi descrita em múltiplos contextos de doença, incluindo a reprogramação metabólica associada ao cancro, tornando-o relevante para estudos de biologia de transportadores, proliferação e mecanismos de transporte de fármacos.

CNT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC28A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CNT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC28A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC28A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CNT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC28A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CNT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CNT1 em células tumorais com expressão de SLC28A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.