CMTM6 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (m): sc-426447

Visão geral

Cmtm6 codifica a CMTM6, uma proteína de membrana com quatro domínios transmembrana que estabiliza a PD-L1 na superfície celular ao limitar sua ubiquitinação e degradação lisossomal, moldando assim a sinalização de checkpoints imunológicos. Por meio da regulação da renovação (turnover) de PD-L1 e do tráfego endossomal, a CMTM6 influencia a dinâmica de apresentação de antígenos e mecanismos de evasão imune em diversos tipos celulares, incluindo linhagens tumorais e mieloides. A CMTM6 de camundongo é frequentemente estudada no contexto da sinalização inflamatória, das interações tumor–sistema imune e de respostas induzidas por interferon que modulam a expressão de ligantes de checkpoint. A elucidação da função de Cmtm6 dá suporte a estudos mecanísticos da regulação de PD-L1, do controle de qualidade de proteínas de membrana e de vias que governam a supressão imune adaptativa em modelos de doença.

O CMTM6 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene Cmtm6 em mouse linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus Cmtm6, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o CMTM6 Plasmídeo HDR (m) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido Cmtm6.
Quando co-transfectado com o CMTM6 Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (m):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto Cmtm6.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus Cmtm6 e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) Cmtm6 crítico(s) para a função CMTM6
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.