Ceramide Kinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404164-ACT

O CERK humano codifica a ceramida quinase, uma quinase lipídica que fosforila a ceramida para gerar ceramida-1-fosfato (C1P), deslocando o equilíbrio dos esfingolipídios da ceramida pró-apoptótica para pools de C1P competentes para sinalização. A atividade de CERK sustenta o tráfego de membranas e a sinalização inflamatória, e interage com vias que regulam a sobrevivência celular, a proliferação e as respostas ao estresse por meio da modulação do metabolismo de esfingolipídios. Ao controlar o eixo ceramida/C1P, o CERK influencia processos como a produção de eicosanoides, o transporte vesicular e a dinâmica do citoesqueleto. A sinalização de esfingolipídios dependente de CERK, quando desregulada, tem sido implicada em contextos como a biologia do câncer, a neuroinflamação e a disfunção metabólica, tornando o CERK um ponto relevante para estudos mecanísticos de sinalização mediada por lipídios.

Ceramide Kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CERK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ceramide Kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CERK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CERK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ceramide Kinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CERK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ceramide Kinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ceramide Kinase em células tumorais com expressão de CERK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.