CENP-F Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430783-ACT

Cenpf codifica a CENP-F, uma grande proteína associada ao cinetócoro, rica em estruturas coiled-coil, que se acumula do final de G2 até a mitose e coordena o alinhamento cromossômico, a sinalização do checkpoint do fuso e a segregação fiel das cromátides-irmãs. A CENP-F contribui para a dinâmica de ligação microtúbulo–cinetócoro e se integra a redes regulatórias do ciclo celular que controlam a progressão mitótica e a citocinese. A expressão ou função desregulada de CENP-F está ligada à instabilidade cromossômica e à proliferação aberrante, tornando Cenpf um ponto útil para estudar mecanismos associados à aneuploidia na biologia do câncer e em distúrbios do desenvolvimento. Em sistemas murinos, a perturbação de Cenpf sustenta análises mecanísticas do controle mitótico, da estabilidade genômica e da homeostase tecidual dependente da divisão celular.

CENP-F O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cenpf sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CENP-F O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cenpf em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cenpf, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CENP-F. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cenpf nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CENP-F no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CENP-F em células tumorais com expressão de Cenpf silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.