CD3-δ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401519-ACT

CD3D codifica a CD3-δ, um componente central do complexo receptor de células T (TCR)–CD3, indispensável para a ativação das células T dependente de antigénio e para a propagação do sinal. A CD3-δ participa na montagem e na expressão à superfície do complexo TCR e transmite sinais através do seu motivo ITAM citoplasmático, recrutando LCK/ZAP70 e vias a jusante como LAT/SLP-76, PLCγ1–NFAT, NF-κB e MAPK/ERK, para coordenar programas de proliferação e de citocinas. Alterações na expressão ou na função de CD3D podem perturbar o desenvolvimento de timócitos, a competência de sinalização do TCR e a homeostase imunitária, tornando-o relevante para estudos de imunodeficiência, desregulação imunitária e interações tumor–sistema imunitário. Como marcador definidor da linhagem de células T, a CD3-δ também é amplamente utilizada para modelar limiares de sinalização do recetor e estados de ativação em células imunitárias humanas.

CD3-δ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CD3D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD3-δ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CD3D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CD3D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD3-δ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CD3D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD3-δ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD3-δ em células tumorais com expressão de CD3D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.