Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCT A: sc-404021-ACT

PCYT1A code la cytidylyltransférase de la choline-phosphate A (CCT A), enzyme limitante de la voie du CDP-choline (voie de Kennedy) qui produit la phosphatidylcholine, un lipide structural majeur des membranes eucaryotes. En contrôlant la synthèse de phosphatidylcholine, CCT A influence la biogenèse des membranes, la dynamique des gouttelettes lipidiques et l’homéostasie du réticulum endoplasmique (RE) et de l’appareil de Golgi, reliant la disponibilité en lipides à la fonction des organites et à la croissance cellulaire. L’activité de PCYT1A s’inscrit aussi dans un cadre plus large de remodelage des phospholipides et du métabolisme des lipoprotéines, façonnant la composition membranaire et la capacité de signalisation. Une fonction altérée de PCYT1A est associée à des maladies héréditaires du métabolisme des phospholipides et peut affecter les réponses au stress cellulaire ainsi que les programmes de différenciation, avec des répercussions pertinentes pour des phénotypes métaboliques et neurodéveloppementaux.

CCT A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCYT1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCT A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCYT1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCYT1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCT A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCYT1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCT A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCT A dans les cellules tumorales présentant une expression de PCYT1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.