CCDC111 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404310-ACT

PRIMPOL (também conhecido como CCDC111) codifica a PrimPol, uma primase–polimerase que possibilita o reinício da replicação e a tolerância a danos no DNA quando as forquilhas de replicação encontram lesões ou estruturas secundárias do DNA. A PrimPol favorece a reprimagem a jusante de forquilhas estagnadas e contribui para o preenchimento de lacunas pós-replicativas, vinculando sua atividade a vias de manutenção do genoma que se cruzam com respostas ao estresse replicativo dependentes de ATR. A alteração da função de PRIMPOL tem sido associada ao aumento da mutagênese e à sensibilidade ao estresse genotóxico, tornando-o relevante para estudos de fidelidade da replicação e de respostas celulares a danos no DNA endógenos e exógenos. Como enzima nuclear que atua em forquilhas de replicação sob desafio, o PRIMPOL é frequentemente investigado no contexto de estresse replicativo, estabilidade da forquilha e manutenção da integridade cromossômica.

CCDC111 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRIMPOL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CCDC111 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRIMPOL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRIMPOL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CCDC111. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRIMPOL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CCDC111 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CCDC111 em células tumorais com expressão de PRIMPOL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.