CASPR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402760-ACT

CNTNAP1 codifica a proteína 1 associada à contactina (CASPR), uma molécula de adesão celular da superfamília das neurexinas, concentrada nas junções paranodais de axônios mielinizados. A CASPR coordena as interações axônio–glia ao organizar junções do tipo septado e promover a localização adequada de canais iônicos necessários para uma condução saltatória eficiente. Por meio de seus domínios extracelulares de adesão e de interações intracelulares com proteínas de ancoragem (scaffolding), a CASPR contribui para a montagem e a manutenção da arquitetura dos nódulos de Ranvier e para a integridade geral dos circuitos neuronais. A disfunção de CNTNAP1 tem sido associada a fenótipos neurodesenvolvimentais graves e a neuropatias periféricas, tornando-o um alvo relevante para o estudo da biologia da mielinização e da organização dos domínios axonais.

CASPR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CNTNAP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CASPR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CNTNAP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CNTNAP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CASPR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CNTNAP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CASPR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CASPR em células tumorais com expressão de CNTNAP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.