Calnexin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-419436-ACT-2

O gene Canx do camundongo codifica a calnexina, uma chaperona de membrana do retículo endoplasmático (RE) que se liga a glicanos N-ligados monoglicosilados para promover o dobramento, a montagem e a retenção de glicoproteínas nascente dentro do ciclo calnexina/calreticulina. A calnexina atua no controle de qualidade e na proteostase do RE ao coordenar-se com a ERp57 e oxidoredutases relacionadas, influenciando a formação de pontes dissulfeto, a degradação associada ao RE (ERAD) e a resposta a proteínas mal dobradas durante o estresse do RE. A interrupção da vigilância de dobramento dependente de Canx pode desestabilizar a homeostase da via secretória e tem sido associada a fenótipos relevantes para o neurodesenvolvimento, a mielinização e a função imune em modelos murinos nos quais a maturação de glicoproteínas é crítica. A edição gênica de Canx dá suporte a estudos mecanísticos da biogênese de glicoproteínas, da sinalização de estresse do RE e do tráfego de proteínas de membrana e secretadas em diferentes tipos celulares e em contextos relevantes para doenças.

Calnexin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Canx sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calnexin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Canx em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Canx, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calnexin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Canx nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calnexin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calnexin em células tumorais com expressão de Canx silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.