Calnexin CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-419436-ACT-2

Das murine Canx-Gen kodiert Calnexin, ein membranständiges Chaperon des endoplasmatischen Retikulums (ER), das an monoglucosylierte, N‑verknüpfte Glykanstrukturen bindet, um die Faltung, Assemblierung und Retention neu synthetisierter Glykoproteine im Rahmen des Calnexin/Calreticulin-Zyklus zu fördern. Calnexin trägt zur Qualitätskontrolle und Proteostase im ER bei, indem es mit ERp57 und verwandten Oxidoreduktasen koordiniert und dadurch die Bildung von Disulfidbrücken, den ER‑assoziierten Abbau (ERAD) sowie die unfolded protein response bei ER‑Stress beeinflusst. Eine Störung der Canx‑abhängigen Faltungsüberwachung kann die Homöostase des sekretorischen Weges beeinträchtigen und wurde in Mausmodellen, in denen die Reifung von Glykoproteinen entscheidend ist, mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Neuroentwicklung, Myelinisierung und Immunfunktion relevant sind. Die Geneditierung von Canx ermöglicht mechanistische Studien zur Biogenese von Glykoproteinen, zur ER‑Stresssignalgebung und zum Transport membranständiger und sekretierter Proteine über verschiedene Zelltypen hinweg sowie in krankheitsrelevanten Kontexten.

Calnexin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Canx-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calnexin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Canx-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Canx-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calnexin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Canx-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calnexin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calnexin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Canx-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.