C3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400622-ACT

Il componente 3 del complemento umano (C3) è un nodo centrale della cascata del complemento, prodotto come zimogeno secreto che viene scisso proteoliticamente in C3a e C3b per amplificare le risposte immunitarie innate. C3b opsonizza covalentemente i bersagli favorendo la fagocitosi e la rimozione dei complessi immuni, mentre C3a agisce da anafilotossina modulando il reclutamento leucocitario e la segnalazione infiammatoria. Integrando le vie classica, lectinica e alternativa, C3 regola la difesa dell’ospite, la potatura sinaptica e il crosstalk con le reti della coagulazione e delle citochine. Un’attività o un processamento di C3 deregolati sono implicati nell’infiammazione mediata dal complemento e nel danno tissutale, con rilevanza per le malattie autoimmuni, la biologia delle infezioni e condizioni neuroinfiammatorie e degenerative.

C3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C3 nelle cellule tumorali con espressione di C3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.