BRDT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416531-ACT

BRDT (bromodomain testis-associated) é um leitor de cromatina da família BET que reconhece lisinas acetiladas nas caudas de histonas para regular programas transcricionais durante a espermatogênese e a diferenciação de células germinativas. Ao modular a acessibilidade da cromatina, o BRDT influencia a expressão gênica dependente da RNA polimerase II, o remodelamento da cromatina e o controle epigenético de vias relacionadas à meiose. A regulação aberrante de proteínas BET, incluindo o BRDT, tem sido associada a estados transcricionais alterados relevantes para a biologia do câncer, em que a atividade de enhancers dependente de bromodomínio e os programas de linhagem podem tornar-se desregulados. Como um fator enriquecido nos testículos com interações mediadas por bromodomínio bem definidas, o BRDT é um modelo útil para estudar a regulação transcricional dependente de acetilação e a dinâmica da cromatina.

BRDT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BRDT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BRDT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BRDT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BRDT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BRDT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BRDT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BRDT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BRDT em células tumorais com expressão de BRDT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.