BRAF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400121-ACT

BRAF codifica una chinasi proteica serina/treonina che agisce come effettore chiave nella cascata di segnalazione RAS–RAF–MEK–ERK (MAPK), trasmettendo i segnali provenienti dalle tirosin-chinasi recettoriali attivate ai programmi trascrizionali nucleari. Regolando la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione, la sopravvivenza e le risposte allo stress, BRAF integra gli stimoli extracellulari in cambiamenti dell’espressione genica dipendenti dal contesto. Un’attività di BRAF deregolata altera l’output della via MAPK ed è fortemente associata a segnalazione oncogenica, a una plasticità cellulare modificata e a fenotipi di risposta alle terapie in diversi modelli tumorali. Poiché la segnalazione MAPK dialoga con PI3K/AKT e con regolatori di feedback quali le DUSP e le proteine SPRY, BRAF è ampiamente studiato per la dinamica delle vie di segnalazione, l’adattamento del segnale e i meccanismi di resistenza.

BRAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BRAF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BRAF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BRAF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRAF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BRAF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRAF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRAF nelle cellule tumorali con espressione di BRAF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.