BNIP-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419356-ACT

O gene Bnip3 de camundongo codifica a BNIP-3, um membro da família BCL2 do tipo “BH3-only” induzível por hipóxia, que se localiza principalmente na membrana externa mitocondrial e regula a homeostase mitocondrial. A BNIP-3 promove a despolarização mitocondrial, a mitofagia e a morte celular programada por vias ligadas à sinalização de HIF-1, ao fluxo autófago (autofagossomo–lisossomo) e ao crosstalk com reguladores da apoptose. Em tecidos sob estresse metabólico, a BNIP-3 ajuda a ajustar o equilíbrio entre a sobrevivência e a eliminação de mitocôndrias danificadas, modulando a produção de espécies reativas de oxigênio e a adaptação bioenergética. A atividade desregulada de BNIP-3 tem sido implicada em contextos de lesão isquêmica, neurodegeneração e hipóxia no microambiente tumoral, tornando-a um nó útil para estudar adaptação ao estresse e controle de qualidade mitocondrial em modelos murinos.

BNIP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Bnip3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BNIP-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Bnip3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Bnip3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BNIP-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Bnip3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BNIP-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BNIP-3 em células tumorais com expressão de Bnip3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.