BMAL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400808-ACT

ARNTL (BMAL1) é um fator de transcrição central da família basic helix–loop–helix PAS que forma heterodímeros com CLOCK/NPAS2 para impulsionar programas de expressão gênica circadiana por meio de elementos E-box. Esse complexo regula oscilações diárias no metabolismo, na função mitocondrial, no equilíbrio redox, nas respostas a danos no DNA e na sinalização imune, coordenando alças de retroalimentação transcricional com os repressores PER e CRY. Na biologia humana, alterações na atividade de BMAL1 têm sido associadas à desregulação do ritmo circadiano, com impactos a jusante na homeostase metabólica, em vias inflamatórias, em fenótipos neurocomportamentais e na resiliência ao estresse celular. BMAL1 também se conecta a redes de hipóxia e de receptores nucleares, o que o torna um nó útil para estudar a regulação temporal da transcrição e a fisiologia em nível de sistemas in vitro.

BMAL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ARNTL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BMAL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ARNTL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ARNTL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BMAL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ARNTL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BMAL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BMAL1 em células tumorais com expressão de ARNTL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.