BAF53 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403200-ACT

ACTL6A codifica BAF53A, una subunità correlata all’actina del complesso di rimodellamento della cromatina SWI/SNF (BAF) ATP-dipendente, che regola il posizionamento dei nucleosomi e l’accessibilità trascrizionale. BAF53A sostiene il controllo, dipendente dalla cromatina, della progressione del ciclo cellulare, della specificazione di linea e dei programmi trascrizionali in risposta al danno al DNA, interagendo con fattori di trascrizione e con altre subunità BAF per coordinare l’attività di enhancer e promotori. Attraverso il suo ruolo nella regolazione epigenetica, ACTL6A influenza vie legate a proliferazione e differenziamento, inclusi l’organizzazione della cromatina e la regolazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II. Un’espressione deregolata di ACTL6A e alterazioni nella composizione del complesso BAF sono state associate a stati trascrizionali aberranti in diversi contesti tumorali e a fenotipi dello sviluppo, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo epigenetico.

BAF53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACTL6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BAF53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACTL6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACTL6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BAF53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACTL6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BAF53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BAF53 nelle cellule tumorali con espressione di ACTL6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.