ATP6E Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404046-ACT

O ATP6V1E1 humano codifica a subunidade E1 (ATP6E) do domínio periférico V1 da H+-ATPase vacuolar (V-ATPase), uma bomba de prótons multissubunitária que promove a acidificação, dependente de ATP, de endossomos, lisossomos, complexo de Golgi e vesículas secretoras. Ao regular o pH das organelas, a V-ATPase dá suporte à endocitose mediada por receptores, ao fluxo autofagia–lisossomo, à proteostase e a vias de sensoriamento de nutrientes, incluindo a sinalização do mTORC1 na superfície lisossomal. A acidificação dependente de ATP6V1E1 também influencia o processamento de antígenos, o tráfego de membranas e a atividade de enzimas sensíveis ao pH, conectando o gene a mecanismos fundamentais de homeostase celular. A desregulação da função da V-ATPase está associada a alterações no tráfego vesicular e à disfunção lisossomal observadas em uma variedade de fenótipos celulares relevantes para doenças, incluindo contextos de neurodesenvolvimento e estresse metabólico.

ATP6E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6V1E1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATP6E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6V1E1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6V1E1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATP6E. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6V1E1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATP6E no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATP6E em células tumorais com expressão de ATP6V1E1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.