ATP5H Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403948-ACT

ATP5H codifica uma pequena subunidade estrutural da ATP sintase mitocondrial (Complexo V) que auxilia a montagem e a estabilidade do setor F0, necessário para a produção de ATP acoplada ao transporte de prótons. Ao contribuir para a fosforilação oxidativa, ATP5H influencia a homeostase energética celular, o potencial de membrana mitocondrial e o equilíbrio redox, com efeitos a jusante sobre a sinalização dependente do metabolismo e as respostas ao estresse. Alterações na expressão ou na função de subunidades da ATP sintase são frequentemente associadas a fenótipos de disfunção mitocondrial, incluindo bioenergética comprometida e maior sensibilidade ao estresse oxidativo, características recorrentes em diversos distúrbios neuromusculares e metabólicos. Como um nó de bioenergética mitocondrial, ATP5H é relevante para estudos de regulação da cadeia respiratória, controle de qualidade mitocondrial e reprogramação metabólica em estados celulares pertinentes a doenças.

ATP5H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP5H sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATP5H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP5H em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP5H, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATP5H. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP5H nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATP5H no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATP5H em células tumorais com expressão de ATP5H silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.