Atg12 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401894-ACT

O ATG12 humano codifica a Atg12, um modificador do tipo ubiquitina essencial para a autofagia por meio da sua conjugação covalente à ATG5, formando o complexo ATG12–ATG5–ATG16L1, que impulsiona a expansão do fagóforo e a biogênese do autofagossomo. Essa maquinaria sustenta a proteostase basal e a adaptação ao estresse ao permitir a degradação lisossomal de organelas danificadas e de proteínas agregadas, intersectando-se com vias de detecção de nutrientes como mTOR e AMPK. A perturbação do fluxo autofágico regulado por ATG12 tem sido associada a sinalização inflamatória alterada, homeostase celular prejudicada e papéis dependentes do contexto na biologia tumoral e no estresse proteotóxico associado à neurodegeneração. Como um componente central da autofagia, o ATG12 é amplamente utilizado para estudar a comunicação entre vias de controle de qualidade de organelas, respostas imunes inatas e remodelação metabólica.

Atg12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATG12 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Atg12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATG12 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATG12, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Atg12. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATG12 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Atg12 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Atg12 em células tumorais com expressão de ATG12 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.