ATAD5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405654-ACT

O ATAD5 humano codifica uma ATPase AAA+ que regula a estabilidade do genoma ao promover a remoção do PCNA da cromatina durante a replicação e o reparo do DNA. Por meio dessa função, o ATAD5 ajuda a coordenar a progressão da forquilha de replicação, o reparo pós-replicação e a resolução do estresse replicativo, interseccionando-se com vias que preservam a integridade do DNA durante a fase S. A perturbação da atividade do ATAD5 pode aumentar o dano ao DNA associado à replicação e a instabilidade cromossômica, processos frequentemente investigados na biologia do câncer e em outros distúrbios ligados a respostas defeituosas a danos no DNA. Assim, o ATAD5 é amplamente utilizado como ponto de entrada mecanístico para estudar o reparo acoplado à replicação e a sinalização de checkpoints em células de mamíferos.

ATAD5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATAD5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATAD5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATAD5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATAD5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATAD5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATAD5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATAD5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATAD5 em células tumorais com expressão de ATAD5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.