ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド (h): sc-410025
- 対象生物種: human
- 20 µg のトランスフェクション準備済み、精製したプラスミドDNA、～20回トランスフェクション
- ASF1B CRISPR/Cas9 ノックアウト（KO）プラスミド（h）は、GeCKO v2ライブラリ由来の配列を用いて最大のノックアウト効率を実現するよう設計された、Cas9ヌクレアーゼおよび標的特異的な20塩基対のガイドRNA（gRNA）をそれぞれコードするプラスミドのプールです
- gRNA配列は、Cas9を誘導してASF1Bゲノム座において部位特異的な二本鎖切断（DSBs）を引き起こし、非相同末端結合（NHEJ）を介して遺伝子ノックアウトをもたらします
- ASF1B HDRプラスミド（h）（）（sc-410025-HDR）は、ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）との共トランスフェクションに推奨されます。これにより、HDRを介したプテロマイシン耐性カセットおよびRFPレポーター遺伝子の組み込みを通じて、編集に成功した細胞の選別が可能になります
- ASF1B HDRプラスミド（h）は、ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）内のgRNA標的部位に対応する相同性依存修復（HDR）テンプレートをそれぞれ含むプラスミドのプールです
- 各HDRプラスミドには、プテロマイシン耐性カセットおよびRFPカセットを挟む2つの約800 bpのホモロジーアームが含まれており、Cas9によって誘導された二本鎖切断部位周辺のゲノムDNA配列に結合し、HDRを介した正確な組み込みを促進するように設計されている
- ピューロマイシン耐性遺伝子とRFP遺伝子はLoxP部位で挟まれているため、安定したノックアウト細胞株を樹立した後、Creリコンビナーゼ（Creベクター：sc-418923）を用いて選択マーカーを除去することができる。
- トランスフェクションの後、遺伝子ノックアウト効果は、抗体を用いたWB、IFまたはIHCによって検定されることができます: ASF1B 抗体 (C-6): sc-393169
注文情報
| 製品名 | カタログ # | 単位 | 価格 | 数量 | お気に入り | |
ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド (h) | sc-410025 | 20 µg | $397.00 | |||
ASF1B HDRプラスミド (h) | sc-410025-HDR | 20 µg | $445.00 |
概要
ASF1B（anti-silencing function 1B ヒストンシャペロン）は、複製と共役して働くヒストンH3–H4シャペロンであり、S期におけるヌクレオソーム組み立てを支援するとともに、DNA複製および修復の過程でクロマチンの完全性を維持するのに寄与します。ASF1Bは、ヒストンの供給・沈着経路と協調して機能し、ゲノム安定性、複製フォークの進行、細胞周期制御を調節しており、とりわけ増殖性の高い細胞集団で重要な役割を担います。ASF1B発現の変化は、複数のがんにおいて観察される増殖プログラムの破綻やクロマチンストレスのシグネチャーとしばしば関連しており、腫瘍性の細胞周期ネットワークを研究する上で重要な分子です。クロマチン組み立て因子としてのASF1Bは、エピジェネティックな維持機構、複製ストレス応答、ヒストン管理の攪乱に伴う転写上の影響を検証するための機構的な切り口も提供します。
ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）は、human細胞株におけるASF1B遺伝子の標的破壊のために設計されたプラスミドのプールです。このプールに含まれる各プラスミドは、Streptococcus pyogenes Cas9 ヌクレアーゼとともに、ASF1B 遺伝子座内の異なる部位を標的とする固有の sgRNA を共発現し、蛍光による同定と、トランスフェクションに成功した細胞の濃縮を可能にする GFP をコードしています。このマルチガイド戦略は、機能的なノックアウトをもたらすフレームシフトや欠失を誘導する可能性を高め、シングルガイドアプローチに代わる、より堅牢な選択肢を提供します。複数の部位で誘導された二本鎖切断（DSB）は、非相同末端結合（NHEJ）によって修復されるか、または同梱のHDRドナーテンプレートと併用した場合、遺伝子座内の定義された標的部位で相同性依存修復（HDR）によって修復されます。
RFP発現HDRドナーと併用する場合、GFPとRFPの蛍光を併用して、トランスフェクトされた細胞集団と編集された細胞集団を区別できるため、フローサイトメトリーに基づく選別およびクローン選択のワークフローが効率化されます。
相同性依存修復（HDR）ドナー — RFPレポーター付きプロマイシンカセット
確認済みで選択可能なノックアウトクローンを必要とする用途向けに、ASF1B HDRプラスミド（h）には、定義されたASF1Bターゲット部位に特異的なホモロジーアームに挟まれた、プロマイシン耐性カセット（PuroR）および赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターを含むHDRドナー構築体が含まれています。
ASF1B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h）と共トランスフェクションした場合：
- PuroR-RFPカセットはHDRを介してCas9切断部位に組み込まれ、ASF1Bのオープンリーディングフレームを破壊します。
RFP蛍光は、組み込みの成功を即座に視覚的に示す指標となり、プテロマイシン選別前または選別と並行して、蛍光に基づく編集細胞の同定や選別を可能にします。
編集に成功した細胞はプテロマイシン耐性によって確認されるため、クローンスクリーニングの負担を大幅に軽減します。
この選別戦略は、下流の機能解析、薬剤スクリーニング、またはモデル開発のための安定したクローン性KO細胞株の作製に最適です。
Cre-loxカセット除去システム
このHDRドナー構築体には、PuroR-RFP選択カセットを挟むloxPサイトが組み込まれており、クローンの確認後にマーカーをきれいに除去することが可能です。同梱のCreベクター：sc-418923によるCreリコンビナーゼの一過性発現により、カセットが切除され、ASF1B遺伝子座内に最小限の残留loxPサイトが残るだけで、下流のアッセイに対する潜在的な交絡効果が排除されます。
この2段階のアプローチ：
- 局所的なクロマチン構造および近隣の調節要素への影響を最小限に抑えます
編集された遺伝子座において、ほぼ天然の状態に近いゲノム環境を回復させます
同じ細胞株において、さらなる編集のためにプロマイシン選別戦略を再利用可能にします
主な特徴
- ASF1Bの機能に不可欠なASF1Bエクソンを標的とするgRNA
デリバリーを簡素化するため、SpCas9とsgRNAを単一のプラスミドから共発現
陽性クローン選別用のプロマイシン耐性HDRドナー
シームレスなマーカー除去のためのCreリコンビナーゼベクターを備えたloxPで挟まれたPuroRカセット
トランスフェクションによる導入用に即使用可能な状態で提供
研究用のみ。診断用または治療用ではありません。