Arkadia CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403319-ACT

ヒトRNF111はArkadiaをコードしており、ArkadiaはRING型E3ユビキチンリガーゼとして、制御因子をユビキチン化することでTGF-βスーパーファミリーシグナル伝達を調節し、SMAD依存性転写の強度と持続時間を形作ります。ユビキチンを介したプロテオスタシスを通じて、Arkadiaは細胞運命の決定、分化プログラム、ならびに状況依存的な増殖制御を司る核内シグナル出力に影響を与えます。RNF111の活性は転写制御やタンパク質ターンオーバーを制御する経路と交差しており、発生生物学や細胞可塑性の研究において重要です。RNF111に関連するTGF-β/SMADシグナルの破綻およびユビキチン経路ダイナミクスの変化は、複数のモデル系において病的リモデリングや腫瘍関連のシグナル状態と関連付けられています。

Arkadia CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RNF111の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Arkadia CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RNF111 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRNF111転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Arkadiaの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRNF111遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるArkadia依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRNF111発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるArkadia経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。