APPL2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-432068-ACT-2

O gene Appl2 de camundongo codifica a APPL2, uma proteína adaptadora endossomal que contém domínios BAR, PH e PTB e que conecta endossomos precoces positivos para Rab5 à transdução de sinais e ao tráfego de membranas. A APPL2 coordena a endocitose mediada por receptores com vias a jusante, incluindo a sinalização PI3K–AKT e MAPK, influenciando a dinâmica do citoesqueleto, a migração celular e as respostas a fatores de crescimento. Alterações na sinalização da família APPL têm sido associadas à regulação metabólica, à sensibilidade à insulina e a redes de sinalização relacionadas ao câncer, tornando o Appl2 um alvo relevante para estudar o controle da homeostase celular dependente de endossomos. A edição gênica de Appl2 em sistemas murinos sustenta a dissecação mecanística das funções de arcabouço endocítico, do crosstalk entre vias e das relações genótipo–fenótipo em biologia celular e em pesquisas com modelos de doença.

APPL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Appl2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

APPL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Appl2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Appl2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de APPL2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Appl2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de APPL2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via APPL2 em células tumorais com expressão de Appl2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.