Plásmido CRISPR de Activación (h) Apg-1: sc-403942-ACT

HSPA4L codifica Apg-1, un miembro de la familia HSP70 de chaperonas moleculares dependientes de ATP que sostiene la proteostasis al promover el plegamiento de proteínas cliente, prevenir la agregación y facilitar la recuperación frente al estrés celular. Apg-1 participa en respuestas citoprotectoras de choque térmico y en la coordinación de vías de control de calidad vinculadas al recambio por ubiquitina–proteasoma y a la autofagia, ayudando a mantener la homeostasis proteica durante el estrés oxidativo, térmico y del retículo endoplásmico (RE). Dado que el desequilibrio de la proteostasis es una característica común del cáncer, la neurodegeneración y otras patologías asociadas al estrés, la actividad alterada de HSPA4L se estudia en contextos en los que la capacidad de chaperonas, el mal plegamiento proteico y la adaptación al estrés influyen en decisiones sobre el destino celular. La Apg-1 humana también constituye un modelo útil para analizar el “crosstalk” de la red HSP70 con nodos de señalización que acoplan la detección del estrés con la apoptosis, el control del ciclo celular y la remodelación metabólica.

Apg-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HSPA4L sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Apg-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HSPA4L en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HSPA4L, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Apg-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HSPA4L y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Apg-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Apg-1 en células tumorales con expresión de HSPA4L silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.