ANO4 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h2): sc-406887-KO-2

Descripción general

ANO4 (anoctamina 4) codifica un miembro de la familia TMEM16/anoctaminas de proteínas multipaso de membrana, implicadas en el transporte iónico regulado por Ca2+ y en la remodelación de lípidos de membrana. En las vías celulares, las anoctaminas contribuyen a la excitabilidad de la membrana plasmática, a la homeostasis iónica de células epiteliales e inmunitarias, y a eventos de “scrambling” (barajado) de fosfolípidos que influyen en la curvatura de la membrana, la dinámica vesicular y la transducción de señales. Se ha descrito la expresión de ANO4 en múltiples tejidos, incluido el sistema nervioso, lo que respalda la investigación de sus funciones en la fisiología de membrana neuronal y en las respuestas al estrés. La desregulación de la actividad de la familia TMEM16 se ha asociado con alteraciones de la señalización de Ca2+, procesos inflamatorios y fenotipos relacionados con el cáncer, lo que sitúa a ANO4 como una diana relevante para estudios mecanísticos de redes de señalización asociadas a membranas.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO ANO4 (h2) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen ANO4 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus ANO4, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR ANO4 (h2) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido ANO4.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido ANO4 CRISPR/Cas9 KO (h2):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto ANO4.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus ANO4 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones ANO4 críticos para la función ANO4
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.